Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a gene amplification technique whereby the amplification products are commonly visualized as turbidity by naked eye in the presence of magnesium pyrophosphate precipitation. An appropriate intercalating dye is important as it could increase the sensitivity and reduce the false positive and false negative results for the detection. The study aimed to compare the performance of three different intercalating dyes; SYBR Green I, SYBR Safe and calcein-based dyes in HPV-16 LAMP assay by naked-eye visualization, gel electrophoresis and real-time monitoring. The LAMP assay was carried out using a Loopamp DNA amplification kit in 25 μl volumes. The reaction mixture was incubated at 60°C for 60 mins and terminated at 80°C for 5 mins in a real-time turbidimeter. For naked eye detection, SYBR Green I and SYBR Safe were diluted at 1:10 of DMSO and was added to the solution after the reaction was completed while calcein was added before the amplification process. The sensitivity of the LAMP assay was investigated ranging from 101 copies/μl to 108 copies/μl of the HPV 16 DNA template. All three dyes exhibited similar results in term of sensitivity with the detection limit of 103 copies/μl. Addition of calcein dye showed decrease in detection time by 10 mins by real-time turbidimeter. The performance all three dyes for naked-eye detection are comparable and can be used for endpoint screening applications in HPV 16 assay, whereas in real-time evaluation, addition of calcein delay the detection time by 10 mins.
Sensitivity Evaluation of SYBR Green I, SYBR Safe and Calcein Dyes for Detection of Human Papillomavirus 16 by Loop-Mediated Isothermal Amplification
Abstrak
Amplikasi isoterma berpengantara gelung (LAMP) merupakan teknikamplifikasi gen yang menghasilkan produk akhir iaitu mendapan keruh magnesium pirofosfat yang boleh dianalisis dengan hanya menggunakan mata kasar. Penggunaan pewarna interkalat yang sesuai adalah penting kerana ia boleh meningkatkan sensitiviti dan mengurangkan keputusan positif palsu dan negatif palsu untuk pengesanan. Kajian ini bertujuan untuk membandingkan prestasi tiga pewarna interkalat yang berbeza; SYBR Green I, SYBR Safe dan pewarna berasaskan calcein di dalam asai LAMP HPV-16 melalui visualisasi oleh mata kasar, elektroforesis gel dan mesin masa- nyata turbidimeter. Reaksi LAMP dilakukan menggunakan amplifikasi kit Loopamp DNA berisipadu sebanyak 25 μl. Campuran reaksi dieram pada suhu 60°C selama 60 minit dan ditamatkan menggunakan suhu 80°C selama 5 minit dalam mesin masa-nyata turbidimeter. Untuk pengesanan menggunakan mata kasar, SYBR Green I dan SYBR Safe telah dicairkan dalam 1:10 DMSO dan telah ditambah ke dalam tiub yang mengandungi campuran reaksi selepas proses amplifikasi berlaku manakala calcein ditambah sebelum proses amplifikasi. Sensitiviti asai telah disiasat menggunakan pencairan DNA HPV-16 yang berkepekatan bermula dari 101 salinan/ μl to 108 salinan/μl. Ketiga-tiga pewarna mempamerkan keputusan yang sama dari segi sensitiviti dengan had pengesanan adalah 103 salinan/μl. Penambahan calcein di dalam asai menunjukkan masa pengesanan bertambah selama 10 minit dengan menggunakan mesin nyata-masa turbidimeter. Prestasi ketiga-tiga pewarna interkalat untuk pengesanan mata kasar adalah setanding dan boleh digunakan untuk aplikasi pemeriksaan titik akhir dalam asai HPV-16, manakala dengan mesin nyata-masa turbidimeter, penambahan calcein melambatkan masa pengesanan selama 10 minit.
Abstract
|
|
Related Images
